A környezetszennyezés az emberiség egyik nagy gondja. A globális felmelegedés vagy az óceánok, tengerek olajszennyezettsége sok embert foglalkoztat. Nem kell azonban túl messzire mennünk ahhoz, hogy a környezetszennyezés szembeötlő legyen. Közvetlen környezetünkben is vannak olyan toxikus anyagok, amelyekre érdemes odafigyelnünk. Én is igyekeztem odafigyelni egyre, mégpedig a nehézfémekre, közülük is az oldott rézionokra. A nehézfémek általános káros hatásai:

- közvetlenül vagy táplálék útján akut vagy krónikus károsodást okoznak,

- felhasználódnak és raktározódnak,

- amin- és SH-csoportokhoz való affinitásuk miatt szerves molekulákkal komplexet képeznek, ezért az enzimek funkcióképességét megzavarják.

A rézion az emberek és az állatok számára nélkülözhetetlen, nagyobb mennyiségben azonban mérgező. A szövetek közül a máj, a vese, az agy és a szív tartalmazza a legnagyobb koncentrációban. A sejtekben főleg az oxidáz enzimekben van fontos szerepe, például: citokróm-coxidázban, szuperoxid-dizmutázban. A rézionok a bélfalon jutnak át a véráramba, komplex ionok formájában. A vérben a ceruloplazminhoz, illetve az albuminhoz kötődve szállítódnak.

A réz környezetünkben számos helyen előfordul, leggyakrabban vizekben, egyrészt oldot állapotban, másrészt szuszpendált, nem oldódó vegyületek formájában. A szabad rézion a legmérgezőbb, ezért a lágy vizekben előforduló réz sokkal veszélyesebb, mint a kemény vizekben lévő, ahol különböző oldhatatlan csapadékok formájában található.

Számos toxicitási vizsgálatot végeztek, elsősorban tengeri állatokon, halakon. A bioakkumulációs adatok azt mutatták, hogy az agyban nagyobb mértékben halmozódik fel a réz, mint az izomban vagy a májban. A közvetlen toxikus hatást kiváltó dózisnál kisebb mennyiséget ivóvízbe téve azt tapasztalták patkányoknál, hogy a szérumban csökken a lipidek, a koleszterol, a fehérjék, valamint a glikoprotein hexózok koncentrációja. A réz hosszú távú hatásaként karcinogenitást (rákkeltő hatást) figyeltek meg, elsősorban a tüdőben. Ötezer munkás vizsgálata alapján megállapították, hogy a rákos megbetegedések öszszefüggésbe hozhatók a szérum rézszintjével. Emberben a krónikus rézmérgezés okozza a halálos kimenetelû Wilson-betegséget. Azt találták, hogy a szívbetegség előfordulása korrelál az ivóvízben lévő rézkoncentrációval, így WHO-előírás 500 mg/kg koncentrációban szabja meg az ivóvizek maximálisan elfogadható réztartalmát. Érdekes módon más fémionok, például: Mn, Ni, Cr, V, Mo, Ag és Zn valószínûleg „védenek" a réz hatásaival szemben, hiányuk növeli a réz toxicitását.

Molekuláris szinten a nyomelemek (így a réz is általában) oly módon fejtik ki toxikus hatásukat, hogy megzavarnak bizonyos biokémiai funkciókat azzal, hogy megváltoztatnak enzim-ligand-kölcsönhatásokat, valamint a makromolekulák térszerkezetét. Bár nagyon kevéssé ismert az a mechanizmus, amelyen keresztül ezek a hatások érvényesülnek, az újabb adatok arra utalnak, hogy az állatoknál a réz hatása összefügg az oxigéntranszporttal és/vagy az energia-metabolizmussal. Rákokban vizsgálták a réz toxikus hatását kulcsfontosságú enzimekre, melyek részt vesznek az intermedier anyagcsere-folyamatokban, és azt találták, hogy a hexokináz, foszfofruktokináz és piruvátkináz enzimek aktivitásai csökkentek, de ennek mértékét a sejttípus nagymértékben befolyásolja.

Kísérleteimben arra kerestem választ, milyen hatást gyakorolnak a rézionok a glükóz lebomlási folyamatára. Csak egy kicsit kell felidéznünk a gimnáziumban tanultakat, és rögtön rádöbbenünk arra, ha a rézionok ebben a folyamatban valamilyen káros hatást fejtenek ki, akkor ez valamennyi életfolyamatunkra kihat, hiszen az energiatermelő folyamatokat károsíthatja.

Először is egy rövid bevezető a glikolitikus enzimekről és a glikolízisről. Érdemes kicsit jobban átnéznünk ezt a folyamatot, hiszen néhány gimnáziumi tankönyvben hibásan és hiányosan szerepel a mechanizmus.

A glikolízis, mely a legjelentősebb energiatermelő anyagcsere-folyamat a citoplazmában, igen konzervatív, azonos enzimatikus lépéseken keresztül folyik a mikrobiális sejtektől kezdve az emberi szervezetig. A glikolízis során a hat szénatomos glükózmolekula piruváttá (piroszőlősavvá) alakul át. A glikolízis mindegyik lépését más-más enzim katalizálja, melyeknek szerkezete, valamint a katalitikus reakció mechanizmusa jól ismert. Több részre osztható a glikolitikus reakcióút: 1.A glükóz két molekula triózfoszfáttá alakul, ami ATP-ADP-átalakulással kapcsolt folyamat, 2. az egyik triózfoszfát (GAP) aldehid-csoportja karboxilcsoporttá alakul, miközben egy új, nagy energiájú foszfátkötés jön létre.

Egy konszekutív (egymást követő) reakciósor - mint amilyen a glikolízis is - lépései különböző mértékben befolyásolják a reakció sebességét (fluxusát). A legtöbb eukarióta sejtben a glikolízis három fő sebességmeghatározó és -szabályozó enzime a hexokináz, a foszfofruktokináz és a piruvátkináz. A legtöbb állati sejtben a glikolízis útján keletkező piruvát szén-dioxiddá és vízzé oxidálódik a mitokondriumokban mûködő citromsav-ciklus, valamint a mitokondrium membránjában lévő terminális oxidáció révén. Ez az aerob glikolízis, amely intenzíven mûködik azagyban is.

Az aerob glikolízisnél a NAD+ koenzim, mely az oxidációs lépésekhez kapcsoltan mûködik, hidroxi- vagy aldehidcsoportok oxidálódása közben NADH.H+-vá redukálódik. A redukáló ekvivalensek azután a protonpumpával jutnak át a mitokondriumba, a sejtplazmában lévő NADH.H+ pedig kapcsolt reakciókkal oxidálódik ismét NAD+-dá.

Minthogy a glükózlebontás alapvető jelentőségû az agyi sejtekben, így azok a vegyületek, melyek gátolják ezen enzimek katalitikus mûködését, nyilvánvalóan toxikus hatást okoznak sejtszinten azzal, hogy befolyásolják a sejtek energiatermelését.

Kísérleteimben agyhomogenizátumot használtam, ebből nyerhető az ún. „citoplazmatikus frakció".

Az agyhomogenizátum készítésének receptje:

1.A marhaagyat megtisztítjuk, leszedjük az alvadt vért, és lehúzzuk az agyhártyát. Lemérjük az agy tömegét, majd azonos tömegû puffert adunk hozzá, ami proteázgátlókat tartalmaz. Turmixgépben hidegen homogenizáljuk.

2.A homogenizátumot harminc percen át centrifugáljuk.

3.A felülúszót újra centrifugáljuk két órán át.

4.Az itt kapott felülúszó a citoplazmatikus frakció

A továbbiakban gélszûréssel (gélfiltrálással) a fehérjéket elválasztom a kisebb molekuláktól (pl.: sóktól, metabolitoktól). A citoplazmatikus frakciót felolvasztom, majd gélfiltrálom egy Sephadex G-25-ös oszlopon (200x8 mm). A citoplazmatikus frakció gélszûrésénél először a fehérjék jönnek le sómentesen, azután a kisebb molekulák következnek, a második csúcsot pedig valószínûleg a nukleotidok okozzák. Először azokat a frakciókat használom fel - öntöm össze -, amelyek elnyelése 280 nm-en legalább 2,0. Ezek a frakciók enyhén színesek a hem miatt. Az összeöntött frakciók fehérjekoncentrációját úgy határozom meg, hogy megmérem a higított forma fényelnyelését 280 nm-en. Az abszorbancia (elnyelés) számértékét 0,76-tal szorozva megkapom a fehérjekoncentrációt mg/ml-ben kifejezve.

Mire jó az enzimkinetika? A kémiai reakciókat a reakciósebességgel jellemezhetjük. A reakciósebesség az átalakuló anyag időegységre jutó koncentrációcsökkenésével vagy a keletkezett anyag koncentráció-növekedésével mérhető.

A legtöbb enzimre jellemző, hogy az általuk katalizált reakció sebessége (v) állandó feltételek (enzimkoncentráció, ionkoncentráció, pH, hőmérséklet) mellett a szubsztrátkoncentráció [S] függvényében telítési görbét ad: kis [S] mellett csaknem lineárisan változik, kellően nagy [S] mellett csaknem állandó értéken marad. Michaelisés Mentenszerint az enzimkatalízis kinetikáját a következő reakcióegyenlet írja le:

k1 k3 E + S == ES ®E + P k2

Az E-enzim az Sszubsztrátjával K1 sebességi konstanssal jellemezhető sebességgel ES-enzim-szubsztrát komplexet hoz létre. Az ES-komplexkétféleképpen alakulhat tovább: az ES-komplexrészben k2 sebességi konstansú sebességgel viszszaalakul szabad enzimmé és szubsztráttá, részben k3 sebességgel P terméket szolgáltat, miközben az enzim szabaddá válik.

Ezek az összefüggések kapcsolatot teremtenek egyrészről az enzim- és a szubsztrát- koncentráció, másrészről a katalízis sebessége, valamint az egyes közti reakciólépések sebessége között. Kísérleteimben én is ezekre az összefüggésekre támaszkodtam.

Mit kell tudni a spektrofotometriáról? Tudjuk, hogy az anyagok a fényt különbözőképpen (az anyagra jellemző módon) nyelik el.

A fény az anyagokba érve intenzitásváltozást szenved, a spektrofotométer pedig ezt a változást méri. Így megállapítható a vizsgált anyagra jellemző fényelnyelés.

A spektrofotométer növekvő hullámhoszszúságú fénnyel világítja meg a mintát. A vizsgálandó anyag különböző mértékben nyeli el ezeket. Amûszer a megváltozott intenzitást méri.

Ezek után nézzük meg, hogy ezeket az anyagokat és módszereket felhasználva mire juthat egy középiskolás a rézionok toxicitásvizsgálatának területén.

A glikolitikus fluxus mérése:

A glükózbontás első négy lépésének sebességét oly módon határoztam meg, hogy a triózfoszfátok keletkezését követtem időben a séma szerint:

Tehát a NADH.H+ fogyását mértem 384 nm-en.

A mérőelegy 0,8 mM NADH.H+-t, 2 mM MgATP-t tartalmaz. Az abszorbanciát 384 nm-en mértem, 25 °C-on. A fehérjekoncentráció 0,76 mg/ml. Az aktivitást mM/min egységben adtam meg. A pufferben a KCl az ionerősség biztosítása, a MgCl2a MgATP disszociációjának gátlása miatt, a foszfát pedig a glükóz-6- foszfát hexokinázgátló hatásának kiküszöbölése miatt szükséges.

A mérőelegy 2,3 mM NADP-t, 2 mM MgATP-t tartalmaz, a segédenzim glükóz- 6-foszfát dehidrogenáz (Glu-6-P dehidrogenáz) aktivitása kb. 2 U/ml. A mérést 10 mM glükózzal indítottam, az abszorbanciát 340 nm-en mértem, 25 °C-on. A fehérje-koncentráció 0,76 mg/ml. Az aktivitást mM/min egységben adtam meg.

Az abszorbanciát Hewlett-Packard 8451A típusúspektrofotométeren mértem. A mérésekhez kvarcküvettát használtam.

A rézionok gátló hatása nem pillanatszerûen alakul ki a fémion és a citoplazmatikus frakció összekeverésekor, hanem időfüggő módon. Ezért időben követtem a fluxus változását, mégpedig oly módon, hogy inkubáltam a citoplazmatikus frakciókat különböző koncentrációjú CuSO4oldatokkal, és különböző időpontokban mértem a fluxust. A rézionok hatása valóban időfüggő folyamat, a gátlás sebessége függ a fémion- koncentrációtól, és 20 mM rézion-koncentráció esetén csaknem teljes inaktiválódás érhető el mintegy 100 perc után.

A hexokináz gátlása rézionokkal. Megvizsgáltam, hogy a rézion milyen mértékben képes gátolni a hexokináz aktivitását. Azt tapasztaltam, hogy az inaktiválódás lineárisan függ a rézion-koncentrációtól, hasonlóan, mint a fluxus gátlásánál.

A rézionok gátló hatása itt is időfüggő módon alakul ki.

Összefoglalva tehát, a rézionokkal végzett kinetikai analízis adatai alapján megállapíthatom, hogy a rézionok koncentráció- és időfüggő módon gátolják a glikolízis első négy enzime által katalizált fluxust. A gátlásért jelentős mértékben a hexokináz mûködésének akadályoztatása a felelős.

(Kísérleteimet Budapesten az MTA SZBK Enzimológiai Intézetben végezhettem felhasználva a középiskolások számára meghirdetett kutatási lehetőséget, amiért is ezúton mondok köszönetet dr.Orosz Ferencnek, illetve Liliom Károlynak.)

A szerző írásával diákpályázatunkon az Önálló kutatások, elméleti összegzések kategóriában II. díjat nyert.