Középiskolai tankönyvemben olvastam először a fehérjék szerkezetéről. A témát érdekesnek találtam, a leírtakat viszont száraznak. Nem is csodálkoztam ezért azon, hogy osztálytársaimban nem keltett érdeklődést a bonyolult molekulák felépítése. Azért egy pillanatra elevenítsük fel a középiskolában tanultakat.

A fehérje mûködése feltételekhez kötött (megfelelő hőmérséklet, pH stb.). Ha valamilyen sokk éri, elveszti mûködőképes alakját. Ez lehet hő hatására bekövetkező változás (például az emberi szervezetben a láz) vagy erős mechanikai behatás, de a vízelvonószerek, a fémsók is megváltoztathatják a fehérjék térszerkezetét.

Hogyan lehetséges mégis, hogy a hőforrásokban vagy a jégben egyes baktériumok képesek megélni? Mi teszi lehetővé, hogy a lepkék vagy a változó testhőmérsékletû állatok át tudják vészelni a telet anélkül, hogy a hideg hatására az életfontosságú fehérjéik mûködésképtelenné válnának? Vegyük csak a mindennapi tojássütést. Ha feltörjük a tojást, láthatóvá válik a fehérje, ami egyáltalán nem szilárd, hanem inkább nyúlós, folyós szerkezetû. Amikor a forró serpenyőbe tesszük és sütni kezdjük, változást tapasztalunk. Az eddigi folyós részek megszilárdulnak. A fehérjék hő hatására kicsapódnak. Akkor hőforrásokban élő baktériumok fehérjéi miért nem csapódnak ki?

A sejtek nagy százalékát a fehérjék (proteinek) alkotják. A fehérjék határozzák meg a sejt alakját és felépítését, de ezek a biokémiai folyamatok katalizátorai is (enzimek). Habár az örökítőanyag, a DNS információtartalma szükséges egy új sejt létrehozásához, kicsi a közvetlen befolyása a sejt folyamataira. A hemoglobin génje nem tud oxigént szállítani, az oxigén szállításához fehérjére van szükség. A peptid tulajdonságait viszont a gének határozzák meg.

A fehérjék alapegységekből, aminosavakból felépülő makromolekulák. Az emberi szervezetben húszféle aminosav található. Minőségük és sorrendjük határozza meg a fehérjék végleges szerkezetét. A fehérjéknél megkülönböztetünk elsődleges, másodlagos, harmadlagos és negyedleges szerkezeteket. Az elsődleges szerkezetet az aminosavak sorrendje, szekvenciája határozza meg. A másodlagos szerkezet alfa-hélixekből és béta-lemezekből áll. Az alfa-hélix olyan, mint egy spirál. A másodlagos szerkezetek alakítják ki a harmadlagos szerkezetet, ami alapvetően háromféle lehet: állhat csak alfa-hélixből, csak béta-lemezből vagy mindkettőből.

A DNS és az RNS nukleotidláncok kémiailag is hasonlítanak egymásra, de nem annyira változatosak, mint a fehérjék. A peptidek húsz különböző aminosavból épülnek fel, és mindegyiknek megvan a rá jellemző kémiai sajátossága. A variációk száma megengedi, hogy a fehérjék kémiailag nagyon sokoldalúak legyenek, és választ is adhat arra, hogy a sejtben zajló folyamatok katalizálására az evolúció miért nem az RNS-t „választotta".

Mint már említettem, a fehérje alakját az aminosavak szekvenciája (sorrendje) is befolyásolja. A hosszú polipeptidláncban kötések ezrei engednek szabad forgást az egymáshoz kapcsolódó atomoknak, emiatt nagy a fehérjék gerincének hajlékonysága. Ennek ellenére a fehérje nem tud mindenféle alakot felvenni (a fehérjéknek véges számú a konformációjuk). A legtöbb polipeptidláncnak az aminosavak sorrendje határozza meg a szerkezetét. A láncok összekapcsolódhatnak egymással és a vízzel is (változatos, gyenge, nem kovalens kötések kialakításával).

A legtöbb fehérje rögtön fel tudja venni helyes, mûködőképes szerkezetét. Bizonyos anyagok (például oldószerek) hatására a fehérjék elveszthetik szerkezetûket, kitekeredhetnek, denaturálódhatnak. Ha elvonjuk például a kitekerő oldószert, a fehérje magától visszatekeredik eredeti állapotába. Ez arra utal, hogy minden, a fehérje alakjához szükséges információt az aminosav-sorrendnek tartalmaznia kell, különben a kitekert polipeptidlánc nem tudna visszacsavarodni mûködőképes formájába.

Melyek azok a folyamatok, amelyekben kialakulnak a térbeli elrendeződések? A fehérje azon részei, amelyek a vízzel nem tudnak kölcsönhatásba lépni (hidrofób részek) a molekula belsejébe kerülnek. Azok a molekularészletek, amelyek a vízzel kölcsönhatásba lépnek (hidrofil részek), a molekula külső részére kerülnek. Ez azért fontos, mert a sejt 70-90 százaléka víz.

A poláros láncrészek megpróbálnak a molekula külső felszínéhez kerülni, így kölcsönhatásba léphetnek a vízzel és más poláros anyagokkal. Ha a peptidkötések polarizálódtak, más peptidkötések, illetve oldalláncok között léphet fel kölcsönhatás. Szinte minden apoláris rész a molekula belsejében található, ami ezáltal kettőssé válik. A hidrogénhíd-kötések főszerepet játszanak a betekert fehérjemolekula különböző részeinek összetartásában, szerepük döntő fontosságú sok olyan kötésben is, ami a fehérje felszínén jön létre.

Az egymással kölcsönhatásban lévő aminosavak alkotta hálózatnak köszönhető, hogy a legtöbb fehérjemolekula felcsavarodik. Ebben a tömött, gömb alakú formában minden hidrofób láncrész a belső magban található tömötten, kristályosan elrendezve, míg az összetett és szabálytalan külső felszín többpoláros láncrészt tartalmaz. A változatos felszínen elhelyezkedő atomok helyzete és kémiai tulajdonságai teszik az egyes fehérjéket változatossá, és képessé arra, hogy más makromolekulák, illetve kisebb méretû molekulák felszínén különös módon megkötődjenek.

Miért nem tud a peptid abban az állapotban mûködni, ahogyan „megszületett"? Mi késztet egy fehérjét arra, hogy felcsavarodjon végleges, gombolyagszerû, csak rá jellemző szerkezetébe? A fehérjék nagyon bonyolult molekulák. Egyetlen olyan térbeli elrendeződés van, amiben elláthatják feladatukat. Ez a natív konformáció: az atomok elrendeződése a funckióképes fehérjemolekulán belül. A végleges szerkezet kialakulásához külső segítségre nincs szükségük, semmilyen enzim nem járul hozzá a feltekeredésükhöz. Ezek szerint a végleges konformáció terve a fehérje-aminosav sorrendjében van? Ebből az is következik, hogy ha tudjuk egy fehérje aminosav-sorrendjét, előre meg tudjuk határozni végleges szerkezetét, illetve a fehérje mûködését.

E probléma megoldása nem csak elvi jelentőségû. A lendületesen fejlődő biotechnológia nagy reményû termékei az újfajta fehérjék. Újfajta fehérjéket előállító géneket már tudunk tervezni, ugyanakkor az elkészült fehérjék felcsavarodása még sok esetben gondot okoz. Ugyanis nem minden fehérje tekeredik, sőt nagyon kevés azon fehérjék száma, amelyek képesek beletekeredni. A kutatók már szinte lemondtak arról, hogy megtalálják a megoldást. Részletesebb ismereteink csak a kicsi, vízben jól oldható gömb alakú fehérjékről vannak. Ezek a globuláris fehérjék körülbelül 300 aminosavból állnak. A nagyobb méretû fehérjék nem tudnak segítség nélkül felcsavarodni, ehhez más peptidek is kellenek, ezeket chaperonoknak, dajkafehérjéknek nevezték el.

Hogyan csavarodnak fel a fehérjék mûködőképes állapotukba? A felcsavarodással kapcsolatos elméletek megértéséhez meg kell ismernünk pár alapfogalmat. Az első a denaturált állapot. Ez a kitekert állapotot jelenti, ilyenkor a fehérje nem mûködőképes. A kitekert vagy újonnan képződött fehérjéket „gombolyagnak" (random coil) nevezzük. Ebben az állapotban a fehérje egyik része sem különbözik nagyon egymástól. Valójában ez még sincs így. Mindig vannak a láncnak olyan részei, amelyek már felcsavarodtak, visszahajlottak; így különböznek a molekula többi részétől. Lehet, hogy ezek a részek szolgálnak „magként", ami körül aztán a fehérje felcsavarodhat végleges szerkezetébe. A felcsavarodott állapot a natív állapot. Ebben a konformációban a molekula már mûködőképes.

A tudósok nem tudják pontosan, hogyan csavarodnak fel ezek a molekulák.

A legprimitívebb elképzelés szerint a fehérje kipróbál minden lehetséges térszerkezetet, míg rá nem talál az egyetlen stabil konformációra. Ez azonban nem lehet, mivel a fehérjék egy-két másodperc alatt alakítják ki végleges szerkezetüket. Az összes térszerkezet kipróbálásához pedig a világegyetem teljes eddigi életkora sem lenne elegendő (Levinthal-paradoxon).

Egy másik, szélsőséges elgondolás szerint a fehérjék egyetlen meghatározott utat követnek. Egy fehérjeféleség minden molekulája ugyanazon a módon csavarodik. Ez a hipotézis is valószínûtlen, mert a kitekert állapotú fehérjék térszerkezete nem egyforma. Nem tudnak meghatározott módon ugyanabba a térszerkezetbe csavarodni.

A harmadik álláspont szerint több dolog is közrejátszik a felcsavarodásban. Először a hidrofób-hidrofil hatás a döntő. Sokkal fontosabb, mint a térkitöltési igény vagy az elektrosztatikus hatás. A lánc egy tömött alakot vesz fel. Ezt „olvadt gombócnak" (molten globule) is nevezik. A hidrofób aminosavak nagy része pedig a gombóc belsejébe, a hidrofil aminosavak kívülre kerülnek. Ezután a molekula átrendeződik és kialakul a végleges szerkezet.

A negyedik vélemény szerint a másodlagos szerkezetek már jóval azelőtt kialakulnak, hogy a fehérje felcsavarodhatna, így az egyforma fehérjék más-más utakon is eljuthatnak végső állapotukba. Az elgondolás lényege, hogy a csaknem lineáris fehérjeszálakból hamar kialakulnak a stabil másodlagos szerkezetek, melyek egy része harmadlagos szerkezetet is kialakíthat. Ha jól építik fel egymással a kötéseket, viszonylag stabillá válhatnak. Ezeket mikrodoméneknek nevezték el. A mikrodomének elősegítik az egymástól távollévő részek összekapcsolódását. Így segítik a nagyobb molekulaszerkezet kialakulását. A kezdeti felcsavarodás a hidrofób erőkön alapul, majd az ebből származó energiát a molekula lassan feléli a másodlagos és harmadlagos szerkezetek kialakulásával.

Kísérleteimben a hsp90 dajkafehérje funkcióját vizsgáltam. Ehhez egy kisméretû enzimfehérje csavarodását figyeltem meg. Arra, hogy a fehérje magától visszacsavarodik, abból következtettem, hogy a kicsavarás után egy-két másodperccel újra megkötötte a szubsztrátot. Az enzimet először hőhatásnak tettem ki, majd hsp90-et adtam hozzá. A dajkafehérje „csapdába ejtette" az enzimet, ami így nem tudott azonnal visszacsavarodni. Ez abból látszott, hogy egy-két másodperc elteltével sem kötötte meg az enzim a szubsztrátot.

Egyes elméletek szerint az olvadtgombóc-állapotban a fehérjében olyan, 10-15 aminosavból álló peptidpárok lehetnek, amelyek egymás komplementerei. Ezek a párok „összeragadnak" ebben az állapotban. A hsp90-ről azt feltételezték, hogy ezeket az összeragadt peptidpárokat képes széthúzni. Kísérleteim ezt nem igazolták. Amikor a külön szintetizáltatott, összeragadt peptidpárokat és a hőkezelt enzimet összeöntöttem és hsp90-et adtam hozzá, akkor a hsp90 nem a peptidpárokkal törődött, hanem változatlanul az enzimet ejtette csapdába. Nem tudtam tehát bebizonyítani, hogy a hsp90-nek peptidpárokat kötő funkciója is lehet.

Kísérleteimben a enzim a dihidrofolát-reduktáz volt. Ez a dihidro-folsavból csinál tetrahidro-folsavat. Az enzimnek a dihidrofolát molekula a szubsztrátja. Kétféle módszerrel dolgoztam. Először a spektrofotométerrel. Ez a gép azt vizsgálja, hogy az adott oldathoz képest (referencia) mekkora a másik oldat fényelnyelése. A referenciaoldat a puffer volt. Ha az enzim átalakítja a dihidrofolátot, közben egy NADH nevû molekulából NAD keletkezik. Emiatt az oldat fényelnyelése megváltozik. Kísérletem ezen az elven alapult. Elsőként megnéztem tisztán az enzimet mûködés közben. Utána elrontottam a szerkezetét, és semmilyen kötődést nem érzékeltem. Megnéztem a fehérje mennyi idő múlva nyeri vissza újra térszerkezetét. Harmadjára hsp90-et adtam hozzá. A hsp90 csapdába ejtette a kitekeredett enzimet, ami így nem tudta ellátni a feladatát. Feltételezéseim szerint a dihidrofolát tekeredése közben átmegy egy olyan állapoton, ami 10-15 összeragadt peptidpárt tartalmaz. Elképzelhető, a hsp90 egyik feladata az, hogy széthúzza a peptidpárokat, s ezzel megindítja a fehérje további tekeredését. Emiatt a negyedik esetben az elrontott enzim mellé külön szintetizált, összeragadt peptidpárokat is adtam. Az enzim továbbra sem tudta ellátni a feladatát. Ebből arra következtettem, hogy a hsp90 nem a peptidpárok széthúzásával, hanem az enzimmel foglalkozott.

Másik kísérleti módszerem a felületi plazmonrezonancia (spr = surface plasmon resonance) mérése volt. Az eljárás során fényvisszaverődést mérünk. A fényt 1-2 mikron vastag aranyfüstlemezen vezetjük át, amely mögött egy gél van. Ez a gél képes megkötni a hsp90-et. Az aranyfüstlemezen áthatoló, illetve visszaverődő fényből következtethetünk a gélhez kötött anyagmennyiségre. Itt is ugyanazt akartuk bizonyítani, mint az első esetben, de most sem kötötte a hsp90 a peptideket.

A peptidpárok nem gátolják a dajkafehérje hatását és nem kötődtek számottevően a hsp90-hez.

Habár a hsp90-nel végzett kísérletek nem támasztották alá elképzeléseimet, tovább próbálkozom, hiszen megértettem, a probléma megoldásnak többféle útja van, s nekem kell felfedeznem, melyik a helyes, feladni pedig semmit sem szabad.

Ugyanakkor „beleszerettem" a fehérjékbe, megtudtam, hogy csak a laikus gondolkodhat száraz tudományról, a kísérletezőnek mindig jut édes nedû, csak ki kell várni, míg a természet betekintést enged titkaiba.

A cikk szerzője az Önálló kutatások, elméleti összegzések kategóriában II. díjat nyert.