Az orvosbiológiai kutatások egyik hajtóereje az a kíváncsiság, amely az egészet felépítő részek mûködésének, együttmûködésének, logikájának, azaz a szabályozás megismerésére irányul. Egyre újabb és újabb „rétegek" válnak le az eddig megfejthetetlennek gondolt eseményekről és ma már molekuláris szinten keressük az összefüggéseket, beleértve a mûködés hibáit, a betegségek okait is. Ez a terület a molekuláris medicina,és ennek egyik ága a molekuláris patológia.A patológia az orvoslás egyik alaptudománya, tárgya a betegségek létrejöttének, lefolyásának tisztázása mellett a lehetséges diagnosztikai és terápiás történések értékelése. Ugyanakkor a patológia részese is a diagnosztikának, hiszen igen sok betegség kezeléséhez elengedhetetlen a patológiai diagnózis.

Az utóbbi negyven évben a patológia területén is szemtanúi lehettünk annak a jelenségnek, hogy a rutineljárások - elsősorban a klasszikus szövettan - mellett egyre több, a mindennapi diagnosztikai munkát érintő speciális technika jelenik meg. Gondoljunk a hatvanas évek elektronmikroszkópiájára, klasszikus citogenetikájára, amit az immunhisztokémia, a citometria, majd a DNS-hibridizációs módszerek követtek, ma pedig a molekuláris eljárások újabb generációja jelent meg a patológiai laboratóriumokban, közöttük is elsősorban a PCR (polimeráz láncreakció), vagy a FISH (fluoreszcens in situ hibridizáció), illetve ezek változatai (1. táblázat).(A PCR, a polimeráz láncreakció során egy adott génszakaszt „szaporítunk fel" sokmilliószorosra, enzimek, polimerázok segítségével, így ez a szakasz azonosíthatóvá, továbbvizsgálhatóvá válik. A FISH-ben a fluoreszcens próba a makromolekulák izolálása nélkül helyben - in situ - kötődik a kérdéses génszakaszhoz, metszetben, kenetben, vagy kromoszóma-preparátumban.)

1. táblázat. Gyakoribb molekuláris patológiai módszerek

Ezek a módszerek új korszakotnyitottak a tudományos kérdések megválaszolásában, a betegségek kialakulásának, lefolyásának megismerésében. Annak megítélése azonban eléggé kérdéses, hogy mennyire segítik mindezek a mindennapi diagnosztikai és prognosztikai patológiai munkát. Öncélúak-e vagy valóban olyan forradalmi változást okoztak ezen a területen, mint ahogy azt sokan és sokszor hangoztatják. Akövetkezőkben főleg erre a kérdésre keressük a választ, elsősorban daganatokkal kapcsolatos példákkal, részben mert a patológia vizsgálódási területét jelentős mértékben ezek a betegségek jelentik, részben pedig a szerző szakmai érdeklődése miatt.

Az egészségügyi ellátás egyik kulcskérdése az, hogy milyen hatékonyan tudjuk megelőzni a betegségeket, ha ismerjük az okokat, vagy a hajlamosító tényezőket. Számos esetben sikerült már azonosítani azokat a génhibákat, amelyek felelősek bizonyos kórképek kialakulásáért (ilyenek állnak általában az öröklődő anyagcsere- betegségek hátterében), vagy a kialakulás esélyét fokozzák (azaz rizikó-, kockázatot növelő tényezők). Az említettek azonosításában igen fontos szerepet játszanak a patológiai minták, nemcsak a frissen nyert sejtek vagy szövetek, hanem az archívumokban található rögzített anyagok is (hiszen DNS-t, sőt RNS-t is ki lehet vonni belőlük.) A „molekuláris" hiba alatt szûkebb értelemben a DNS szerkezeti zavarát értjük, tágabb értelemben ide tartozik a gén átíródásában (mRNS), és végső soron a szintetizált fehérje mennyiségében vagy minőségében, azaz funkciójában észlelhető hiba. A fehérjéket rendszerint immunhisztokémiai módszerekkel mutatjuk ki. Tudnunk kell, hogy e szintek között (DNS-mRNS-fehérje) nem mindig található összefüggés. Előfordul, hogy a génhiba nem jár a fehérje mennyiségi vagy mûködési zavarával, de az is lehetséges, hogy a gén hibátlan átíródása ellenére fehérje nem mutatható ki, vagy jelen van, de nem funkcionál megfelelően (utóbbi nemritkán hormonreceptorok esetében fordul elő).

A génhibák (mutációk) kimutatására sok módszer áll rendelkezésre. Korai felismerésük igénye főleg a prenatális diagnosztika és a genetikai tanácsadás területére esik. A 2. táblázatpéldaként mutatja a hibák sokféleségét, és azt, hogy ezeket milyen stratégiával lehet felismerni.

2. táblázat. Génhibák kimutatása öröklődő betegségekben

Daganatok esetében a betegség és a génhibák kapcsolata sokkal komplexebb, annak ellenére, hogy a daganatokat is genetikai betegségeknek tartjuk. Az is biztos azonban, hogy előidézésükben nem egy, hanem számos génhiba játszik szerepet, lefolyásukat pedig a DNS-t nem érintő események (epigenetikai zavarok) is befolyásolják. (Utóbbiak nyilván nem feltétlenül rögzülnek az utódsejtekben, de lehetővé tesznek - pl. proteolitikus enzimek aktivitása révén - olyan eseményeket, mint a daganatsejtek átjutása az ér falán. Ha átjutott a daganatsejt és letelepedett, akkor már a genetikai hibák miatti folyamatos szaporodás a legfontosabb, és a proteolitikus képességre átmenetileg nincs szükség.) A daganatokkal kapcsolatos génhibák lehetnek szerzettek vagy veleszületettek. Utóbbiak ismerete azért fontos, mert hajlamosíthatnak a betegség kialakulására, aminek az esélye igen tág határok között mozog. Előfordul, hogy a kockázat fokozódása alig haladja meg a nem érintett (azaz normál) populációét, de az is, hogy bizonyos életkorra a hordozók igen nagy százalékában, vagy mindegyikében (!) várható a rosszindulatú daganat megjelenése. Utóbbi esetekben a fokozott kockázat nemcsak azt jelenti, hogy a hordozókat fokozott figyelemmel kell nyomonkövetni, hanem terápiás beavatkozást is indokol. Természetesen ma még elég nagy vita tárgya az, hogy ezeket a genetikai szûrő, vagy követő vizsgálatokat daganatos betegek esetében kiknél, milyen életkorban és milyen gyakran stb. kell elvégezni. A mérlegelendő tényezők közé kell sorolni a költségeket is, annak ellenére, hogy a költség-haszon elemzés daganatos betegeket illetően az első pillanatban riasztónak, vagy elfogadhatatlannak tûnik. A 3. táblázatmutat be (amerikai forrás) néhány adatot erre vonatkozóan.

3. táblázat. Daganatos „hajlam" genetikai vizsgálata és költségei

Az utóbbi években jelentős előrehaladás történt az öröklődő daganatos szindrómák és a daganatkialakulási hajlamot jelentő öröklődő tényezők felismerésében. Bár ritka állapotokról van szó, fontosságukat az hangsúlyozza, hogy az érintett családokban a daganatok előfordulása (a penetrancia) igen magas lehet. Számos esetben a daganat jellege, vagy fellépésének időpontja, pl. fiatalkori vastagbélrák, kétoldali veserák, vagy mesenterialis desmoid fibromatosis fel kell hogy vesse a specifikus genetikai hajlam lehetőségét, melynek igazolására igen sokszor éppen a patológiai minta alkalmas.

A kockázati tényezők közé sorolhatók azok a genetikai polimorfizmusok (genetikai változatok), amelyek a detoxikálás első (pl. p450) és második fázisában (pl. N-acetil transzferáz, glutation-Stranszferáz) szereplő enzimek aktivitásában eredményeznek eltéréseket. A szervezetbe bekerülő, vagy ott keletkező anyagok károsak lehetnének, ha nem mûködne a detoxikálás, azaz az anyagok átalakítása ártatlan formává. Sajnos előfordul, hogy éppen ez az átalakítás teszi lehetővé azt, hogy bizonyos kémiai anyagokból génhibát okozó változatok jöjjenek létre. Érzékeny egyénekben sokkal kevésbé tudják ezek az enzimek megakadályozni, hogy bizonyos carcinogének (policiklusos aromás szénhidrogének) és a DNS között mutagén komplexek - azaz génhibák - alakuljanak ki. Hasonló, az érzékenységet befolyásoló polimorfizmust észleltek carcinogéneket (pl. dioxint) megkötő receptorok vagy hormonreceptorok (pl. ösztrogén) esetében. Elképzelhető, hogy a közeljövőben pl. a daganatmegelőző állapotok megítélésében, kezelésében, nyomonkövetésében ezeknek a polimorfizmusoknak a meghatározása a patológiai mintákban igen fontos lesz.

Általános az a törekvés a diagnosztikában, hogy kevésbé invazív, és kevésbé költséges módszereket alkalmazzunk - természetesen úgy, hogy a diagnózisok ugyanakkor legyenek gyorsak, pontosak, és minél kevesebb vagy kisebb mintából (sejtből/szövetből) történjenek. Sok olyan módszer áll rendelkezésünkre, amely eléri, vagy megközelíti ezeket a kívánalmakat. Elvileg a PCR (polimeráz láncreakció) egy sejtből is ki tudja mutatni a génhibát, az áramlásos citometria pedig néhány ezer sejtből egy-két perc alatt diagnózishoz juttathat (különösen leukémiák, lymphomák esetében). Tudnunk kell azonban, hogy a minta nagyságának csökkenésével megnő a veszélye annak, hogy a minta nem reprezentatív. Különösen probléma lehet ez akkor, ha a betegség heterogén jellegû (pl. ugyanazon daganaton belül igen eltérő megjelenésû területek lehetnek, eltérő biológiai viselkedéssel, vagy terápiás válaszkészséggel), illetve ha a mintavétel után a beteg klinikai követésére nincs lehetőség.

A molekuláris diagnosztika egyik fontos területét jelenti a kórokozók kimutatása, éppen a módszerek érzékenysége és specificitása miatt. A mindennapi gyakorlatban főleg vírusok és baktériumok azonosítása történik (pl. mycobaktérium, cytomegalia vírus, humán papilloma vírus - melynek eltérő altípusai „segítik elő" bizonyos jó- és rosszindulatú daganatok kialakulását). A kimutatást megkönnyíti, hogy nem humán genetikai anyag azonosításáról van szó. Paradoxonként azonban éppen a „túlzott" érzékenység jelenthet problémát az értékelésben, hiszen nem biztos, hogy a kimutatott kórokozó valóban pathogén. Daganatok esetében a diagnosztika fő fegyve- re napjainkban is a klasszikus szövettan (az esetek túlnyomó többségében „elég" is a diagnózishoz), ami nem jelenti azonban azt, hogy az immunhisztokémia vagy a molekuláris technikák ne segítenének a pontosabb elkülönítésben, illetve a betegségek lefolyásának előrejelzésében. Ezt akkor tehetik meg, ha a daganatos sejtek „hordoznak" olyan jeleket („bélyegeket", markereket), akár a sejt felszínén, akár a genetikai állományban, amely jellegzetesnek tekinthető adott daganat típusát, biológiai viselkedését illetően. Különösen fontos ezek alkalmazása, ha terápiás következményük is van. Azt, hogy a molekuláris módszer elsősorban a hematológiai daganatok diagnosztikájában, prognosztikájában, és kezelés utáni állapotuk megítélésében, követésében terjedtek el, részben az magyarázza, hogy ezek a daganatok könnyebben „hozzáférhetők", vizsgálhatók, mint a szolid tumorok, részben pedig az, hogy a klonalitást (azt, hogy egy sejtből származó sejtcsoportról van-e szó) jelző antigén-receptor génjének átrendeződése a gyakran előforduló nem-random (nem véletlen) transzlokációkkal együtt aránylag könnyen kimutatható. A leukémiák és lymphomák diagnózisa leegyszerûsítve az abnormálisan felhalmozódott sejtek típusának (vonalának és differenciáltsági állapotának) meghatározásán alapul, a specifikus génhiba azonosításával, amely gyakran a klonalitást is jelzi. A legtöbb esetben az antigén-receptor gének átrendeződésének vagy a transzlokációknak a kimutatása elegendő a klonalitás igazolásához. Néha azonban szükség van más molekuláris bizonyítékra is: ebben az Xkromoszómához kötött klonalitási vizsgálatok a legértékesebbek (pl. a humán androgén receptor lókusz, melyet igen polimorf trinukleotida, CAG-ismétlések jellemeznek).

A szolid tumorok közül a hámeredetûek elkülönítésében sok újat nem hoztak a molekuláris módszerek, a mesenchymális eredetûeknél azonban igen. Például, eddig különbözőknek gondolt daganatok (PNET - perifériás neuroepitelioma, Ewing-sarcoma, Askin-tumor) hasonlóságára utal, hogy mindegyikben az EWS-gén hibája mutatható ki - mégpedig az FLI-1-lel létrejött fúzió (T:11;22). Kiderült, hogy az EWS-gén bizonyos tumorokban más génekkel fuzionál, így ma már az EWS-sel kapcsolatos mesenchymális daganatok családjáról beszélhetünk. Az kérdés még, hogy a közös vagy hasonló molekuláris patogenezis - amit az EWS érintettsége alapján feltételezünk - hasznosítható információt nyújt-e olyan kezelés kialakításában, amely éppen az EWS hibáit célozza. Az pedig még további kérdés, hogy ez a génterápiás beavatkozás eredményes lesz-e? További példák helyett leszögezhetjük, hogy a genetikai hibák kimutatása általában a daganatok diagnosztikájában kevéssé hasznosítható, bizonyos daganatok esetében viszont elkerülhetetlen.

A patogenezis molekuláris szintû megismerése elvileg lehetővé teszi az erre alapozott terápia tervezését. Ez vonatkozhat a tumorban észlelt, és a daganat keletkezésével valószínûleg összefüggő génhibára (mint leukémiák esetében a transzlokációk során kialakult hibák ismeretére alapozott kezelés, pl. retinolsav alkalmazása akut promyelocytás leukémiában, vagy génterápiás próbálkozások fúziós génekkel szembeni antiszenz oligonukleotidokkal CML-ben), de érinthet a kezelést befolyásoló egyéb gént, illetve ezek aktivitását (pl. multidrog rezisztencia gén, vagy DNS-hibát javító - repair - gének).

Igen fontos, és a kezelést befolyásoló kérdés a minimális reziduális betegségjelenléte vagy hiánya (azaz, hogy a kezelés után maradt-e daganatsejt a betegben). Jelenleg elsősorban leukémiák és lymphomák esetében alkalmazzák a PCR vagy FISH alapú módszereket csontvelőtraszplantáció vagy szisztémás kezelés után. A nagy, és még eldöntetlen probléma az, hogy ezekkel az érzékeny módszerekkel kimutatható betegségjelek (azaz a betegben „továbbélő" génhibák vagy termékek) klinikailag valóban fontosak-e, valóban kiújuláshoz vezetnek-e.

A molekuláris módszerekkel felismerhető génhibáknak számos esetben lehet prognosztikaiszerepük, elsősorban hematológiai betegségeknél, néha lágyrészdaganatoknál. Hámeredetû daganatoknál azonban jóval ritkábban sikerül olyan markert találni, amely kielégíti a feltételeket, annak ellenére, hogy a gyakori daganattípusoknál rengeteg prognosztikainak gondolt tényezőt írtak el (az emlőráknál az utolsó 3 évben pl. száznál több olyan faktort találtak, amelyek valamilyen módon korrelációt mutattak a prognózissal). (Néha különbséget tesznek prognosztikai, és predikciós tényezők között, mondván, hogy az első a beteg sorsát jósolja meg kezelés nélkül, a második pedig a kezelésre várható választ.)

A prognosztikai tényezők alkalmazhatóságára példa - ugyancsak emlőráknál - a HER-2/neu gén hibájának kimutatása. Az erre alapozott kezelési stratégia eredménye az anti-HER-2/neu antitest (Herceptin) kifejlesztése. A HER-2/neu (c-erb-B2) transzmembrán tirozin-kináz receptort kódol, amely jelentős homológiát mutat az epidermális növekedési faktor receptorral (EGFR, c-erb-B1). A gondosan fixált, és beágyazott anyag esetében a génkópia száma (azaz az amplifikáció jelenléte/foka vagy hiánya) és a fehérje (receptor) szintje között igen jó összefüggést találtak. (A vizsgálatok jelentős részét immunhisztokémiával végezték, amelyet azonban a technikai és értékelési problémák jelentősen befolyásolhatnak. Előfordul, hogy egyesek a citoplazmapozitivitást független prognosztikai faktorként értékelik, mások azonban nem, mert a pozitivitás és a kompetitiv PCR-ral meghatározott mRNS-szint között nem mutatkozott összefüggés. A fenti tapasztalatok szerint a legmegbízhatóbb eredményt a génamplifikáció molekuláris vizsgálata, fagyasztott metszeten történő immunhisztokémia, vagy a tumorsejtekből „frissen" nyert citoszollal végzett enzim immunassay adja, míg a fixált minták az ellenőrizhetetlen technológia miatt nem megbízhatók.) Az adatok alapján elfogadható, hogy aHER-2/neu gén amplifikációja, vagy a fehérje túltermelése előnytelen prognosztikai faktor emlőrákban (4. táblázat) - következésképpen gátlása terápiás beavatkozásként tervezhető.

4. táblázat. HER-2/neu gén és fehérje vizsgálata emlőrák prognózisának megítélésében

Természetes talán, hogy az új markerek feltûnése robbanásszerû érdeklődést von maga után, azonban a remények jogosságát több intézményt összefogó, koordinált, és megfelelő értékelési paramétereket alkalmazó vizsgálatoknak kell megerősíteni. Mindezeknek ki kell terjedniük az alkalmazott molekuláris módszerek olyan kérdéseire is, mint pl. a reprodukálhatóság, a normál adatok kiterjedése stb.

Tumorok esetében a komplex genetikai háttér valószínûsíti, hogy a molekuláris prognosztikai markerek esetében panelek alkalmazására, több marker egyidejû vizsgálatára van szükség, melynek technológiai lehetőségei rendelkezésre állnak (pl. DNS-chip - génszekvenciák ezreit felismerő DNS-próbák elhelyezése egy mikrochipen). Ez a vizsgálati „csatarend" (array) adott daganat genetikai profilját határozhatja meg. Kétségtelen, hogy a technológiai és a minták alkalmasságának problémái mellett a magas költségek is nehezítik ma még a napi rutinban történő felhasználást.

A molekuláris vizsgálatok korlátai származhatnak technikai és interpretációs problémákból.

A PCR alapú technikáknál az amplifikálandó (sokszorozandó) lókusz vagy lókuszok nukleotidszekvenciáját ismerni kell. Az amplifikálás után a termék kimutatására számos eljárás áll rendelkezésre (gélelektroforézis hidridizációval vagy anélkül, kolorimetriás, fluroeszcens és kemilumineszcens rendszerek stb.). Ahematológiai daganatok esetében a legtöbb antigénreceptor (Ig vagy TCR) gén átrendeződését DNS-alapú PCR-rel, a transzlokációkat pedig RNS-alapú PCRrel (reverz transzkripciós [RT] PCR) végzik. Számos módosítás is született már, mint a nested-PCR, a multiplex PCR, újabban pedig a termék kvantitatív kimutatására alkalmas PCR-módszerek (realtime PCR [fluorogén próba hasítása], competitiv PCR [belső standard - endogén gén, szintetikus templát - együttes amplifikálásával], „limiting dilution"). APCR-alapú technikák között (ezek vannak túlsúlyban) gondot okozhat a kontamináció (idegen DNS-szennyeződés), vagy a túl sok amplifikációs ciklus miatti álpozitivitás; ha az elváltozás gócos és a minta nem reprezentatív; az egy konszenzus primer alkalmazása; a „rossz" minőségû vagy kevés DNS; az antigénreceptor géneket érintő „ongoing" mutációk és átrendeződések miatti ál-negativitás; illetve a módszerek megfelelő egyöntetûségének és standardizálásának hiánya.

Az értékelés során súlyos hibát jelenthet, ha a molekuláris diagnosztikai eredményeket nem a klinikummal, a szövettannal, az immunfenotípussal, és más fontos adattal együtt értékeljük. A pozitív antigénreceptor PCR egyáltalán nem azonos a malignitással, hiszen számos „benignus" kórkép, főleg az immunszabályozással kapcsolatosak, járhatnak klonális antigénreceptor-átrendeződéssel. Ilyenek pl. az autoimmun betegségek, immundeficienciák, különböző bőrbetegségek, amelyek ugyan hordozhatják a lymphomák kialakulásának nagyobb kockázatát, viszont spontán el is tûnhetnek. Ugyancsak gondolni kell arra, hogy hematológiai betegségekre jellegzetesnek tartott transzlokációkat - pl. t(14;18) follikuláris lymphomáknál, t(9;22) CMLnél, t(2;5) anaplasztikus nagysejtes lymphománál, t(4;11) infantilis leukémiánál - az érzékeny PCR módszerrel egészségesnek látszó egyének normál szöveteiben is kimutattak. E jelenség biológiai értelmezése igen érdekes kihívás, azonban jelzi a molekuláris diagnosztika esetleges csapdáit is. Fontos tudnunk a minimális reziduális betegség értékelésekor, hogy számos esetben a PCR pozitivitás még évekig fennmaradhat, annak ellenére, hogy a betegség nyilvánvalóan teljes remisszióba került. Talán a kvantitatív PCR-technikák kiküszöbölik, vagy mérsékelik ezt a problémát. Mindenesetre a negatív PCR - ebben az esetben - sokkal előrejelzőbb értékû, mint a pozitív.

Az aligha vonható kétségbe, hogy a patológiai diagnosztika az új évezred kezdetén is döntően a rutin szövettani vizsgálaton fog alapulni. De az sem kétséges, hogy a molekuláris vizsgálatokra egyre inkább szükség van. Ezzel kapcsolatban az állandóan fejlődő technológia mindennapi alkalmazása megköveteli a világos költség-haszon elemzéseket, a módszerek és az eredmények közlésének, dokumentációjának standardizációját. (Legalább olyan professzionalizmust kell megkövetelni, mint bármely más diagnosztikai teszt, pl. klinikai laborvizsgálatok esetében.)

A genetikai hibák felismerésében, értékelésében lélegzetelállító gyorsasággal jelennek meg az új technikák. Néhány már a rutindiagnosztikában is alkalmazásra kerül, mások a közeljövőben várhatóak. Egyesek az immunfenotípus- és genotípus- meghatározás technológiai integrációjából születnek, mások hidat képeznek a kariotípusos és molekuláris citogenetika között, mint pl. a real-time PCR, a DNS (cDNS) chip és microarray, a fluroeszcens immunfenotipizálás és interfázisos citogenetika (FICTION), a fiber fluoreszcens in situ hibridizáció (fiber FISH), vagy a spektrál kariotipizálás (SKY).

A moelkuláris patológia módszereinek alkalmazását azonban nem csak a szakma igényei diktálhatják. A média szinte naponta hozza címoldalon a legújabb genetikai eredményeket (akár megalapozottak, akár nem), és táplálhatja ezek alkalmazásának igényét a fogyasztói társadalom felől. Nem kevésbé érezhető a nyomás a biotechnológiai ipar részéről, amely szinte ontja az újabb és újabb markereket, kiteket, melyek célpontja sokszor éppen a napi patológiai diagnosztika. Ezek jelentőségének megítéléséhez határozott előrelépésre van szükség a molekuláris diagnosztikai és prognosztikai markerek (marker-családok, -panelek!!) klinikai alkalmazhatóságának minél szélesebb körû, egyeztetett vizsgálatában.

A molekuláris szintû események megismerésének előrehaladásával nyert események az akadémiai szférából egyre inkább átkerülnek a patológiai praxisba. Bár a patológusok jelenlegi fő támasza még mindig a rutinhisztológia és (immun) hisztokémia, a közeljövőben a molekuláris diagnosztikai lehetőségek át fogják alakítani a patológia gyakorlatát. Ehhez természetesen olyan szakemberekre van szükség, akik értik a módszereket, ismerik előnyeiket, hátrányaikat, az elméleti jelentőséget és a gyakorlati hasznot. Ezek a kollégák fogják biztosítani, hogy a molekuláris patológia a jövő biomedicinális tudományának egyik fontos hajtóereje legyen.